产品货号：
RFT094
中文名称：
2×SYBR qPCR MasterMix
英文名称：
产品规格：
1ml|5×1ml|20×1ml
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂。已经将 Hot-Start DNA聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液和 SYBR? Green I 等试剂预混成一种适合 Real Time PCR反应检测用 2×MasterMix试剂，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。使用时只需加入模板、引物和水，便可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对目的基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。以50μl qPCR反应体系为例，每次使用25μl 2×MasterMix，1ml可做40次 50μl qPCR反应。
使用方法：
1、冰浴中彻底融化2×qMasterMix，彻底混匀后快甩离心将溶液收集到管底。
2、按照下表在0.2ml PCR管中制备反应体系：
3、快甩离心将反应液收集到管底。
4、检测片段大于300bp，qPCR仪上推荐执行以下程序(三步法)：
检测片段小于300bp，qPCR仪上推荐执行以下程序(两步法)：
注：由于本MasterMix中的Hot-start DNA聚合酶是经过化学修饰封闭的，初始变性95℃ 10分钟是必须的，时间过短会降低酶的活性。
实验结果分析
反应结束后加做融解曲线，以区分扩增产物及引物二聚体。根据扩增曲线和融解解曲线结果可进行PCR定量标准曲线的制作。
注意事项
1、本制品中不含内参染料ROX，ROX染料单独供应。客户并根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加ROX内参染料，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。
2、本制品含SYBR Green I，强光下易分解，使用时避免长时间强光照射本制品。
3、建议在冰上配制qPCR反应液，再放入qPCR仪器中扩增。可以提高扩增特异性，减少背景。
4、-20℃下保存时间较长，有微量沉淀产生，充分混匀后不影响使用。本制品已经优化了反应缓冲液中的Mg2+浓度，无需再调节Mg2+浓度。
5、模板DNA：用本产品，cDNA、基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA等都可作为模板。在添加DNA模板时请注意模板量对PCR扩增的影响。本产品建议添加量为：cDNA添加量不应超过总反应体系的10%；基因组DNA为模板时，为避免在高浓度区域出现线性差的情况，请注意添加量小于500ng；病毒DNA也可作为PCR模板，添加时请以300ng为上限；由于质粒DNA浓度和拷贝数很高，在添加PCR模板之前最好进行稀释梯度试验，以便确定合适的质粒DNA拷贝数。
6、引物：
建议每条引物工作浓度200 nM～800 nM；为得到高灵敏度定量性的数据，引物的设计非常重要。以下列举了设计引物时需注意的一般事项。
a.引物长度请设定为18bp～30bp、GC含量为40%～65%；
b.扩增片段一般小于300bp，如可能请尽量设定在80bp～150bp。过长的片段容易导致扩增效率降低；
c.如设计mRNA为目的片段的引物，设计应尽量横跨内含子，以防止基因组DNA的扩增而引起假阳性；
d.请尽量选择Tm为65℃～67℃；
e.A、G、C、T整体分布尽量均匀。不要有部分的GC rich或AT rich(特别是3'端)。避开T/C(Polypyrimidine)或A/G(Polypurine)的连续结构；
f.避开引物内部或两条引物之间有3个碱基以上的互补序列。二条引物间的3'末端避开有2个碱基以上的互补序列；
g.引物设计完成后要使用BLAST检索确认引物的特异性。
此外，引物的纯化纯度对反应特异性有很大的影响。经过一般纯化、纯度较低的引物荧光强度散乱，容易产生非特异性产物，致使熔解曲线出现杂峰。请尽可能使用HPLC级别纯化，至少要用经Cartridge(OPC)级别以上纯化的引物。
7、对照设计：
a.No template control(NTC)：在qPCR反应体系中仅仅缺少模板。用以检测有无二聚体和试剂有无污染。
b.Reverse Transcripase control：用以评估逆转录反应中有无基因组DNA的污染。在逆转录反应中仅仅不含有逆转录酶。
常见问题及处理：
储存条件：-20℃，避免反复冻融，有效期半年。
相关搜索：2×SYBR qPCR MasterMix
使用方法：
1、冰浴中彻底融化2×qMasterMix，彻底混匀后快甩离心将溶液收集到管底。
2、按照下表在0.2ml PCR管中制备反应体系：
| 50μl反应体系 | 20μl反应体系 | 终浓度 | |
| 2×qPCR MasterMix | 25μl | 10μl | 1× |
| 上游引物 10μM | 1μl | 0.4μl | 0.2μM |
| 下游引物 10μM | 1μl | 0.4μl | 0.2μM |
| ROX Slolution I or II(50×) | 1μl or 不加 | 0.4μl or 不加 | x |
| 模板 | ×μl | xμl | 10pg-100ng |
| 水 | 补至50μl | 补至20μl |
3、快甩离心将反应液收集到管底。
4、检测片段大于300bp，qPCR仪上推荐执行以下程序(三步法)：
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 初始变性 | 95℃ | 10min* | 1 |
| 变性 | 95℃ | 15sec | 40 |
| 退火 | 55℃ | 30sec | |
| 延伸 | 72℃ | 30sec |
检测片段小于300bp，qPCR仪上推荐执行以下程序(两步法)：
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 初始变性 | 95℃ | 10min* | 1 |
| 变性 | 95℃ | 15 sec | 40 |
| 退火和延伸 | 60℃ | 60 sec |
注：由于本MasterMix中的Hot-start DNA聚合酶是经过化学修饰封闭的，初始变性95℃ 10分钟是必须的，时间过短会降低酶的活性。
实验结果分析
反应结束后加做融解曲线，以区分扩增产物及引物二聚体。根据扩增曲线和融解解曲线结果可进行PCR定量标准曲线的制作。
注意事项
1、本制品中不含内参染料ROX，ROX染料单独供应。客户并根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加ROX内参染料，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。
2、本制品含SYBR Green I，强光下易分解，使用时避免长时间强光照射本制品。
3、建议在冰上配制qPCR反应液，再放入qPCR仪器中扩增。可以提高扩增特异性，减少背景。
4、-20℃下保存时间较长，有微量沉淀产生，充分混匀后不影响使用。本制品已经优化了反应缓冲液中的Mg2+浓度，无需再调节Mg2+浓度。
5、模板DNA：用本产品，cDNA、基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA等都可作为模板。在添加DNA模板时请注意模板量对PCR扩增的影响。本产品建议添加量为：cDNA添加量不应超过总反应体系的10%；基因组DNA为模板时，为避免在高浓度区域出现线性差的情况，请注意添加量小于500ng；病毒DNA也可作为PCR模板，添加时请以300ng为上限；由于质粒DNA浓度和拷贝数很高，在添加PCR模板之前最好进行稀释梯度试验，以便确定合适的质粒DNA拷贝数。
6、引物：
建议每条引物工作浓度200 nM～800 nM；为得到高灵敏度定量性的数据，引物的设计非常重要。以下列举了设计引物时需注意的一般事项。
a.引物长度请设定为18bp～30bp、GC含量为40%～65%；
b.扩增片段一般小于300bp，如可能请尽量设定在80bp～150bp。过长的片段容易导致扩增效率降低；
c.如设计mRNA为目的片段的引物，设计应尽量横跨内含子，以防止基因组DNA的扩增而引起假阳性；
d.请尽量选择Tm为65℃～67℃；
e.A、G、C、T整体分布尽量均匀。不要有部分的GC rich或AT rich(特别是3'端)。避开T/C(Polypyrimidine)或A/G(Polypurine)的连续结构；
f.避开引物内部或两条引物之间有3个碱基以上的互补序列。二条引物间的3'末端避开有2个碱基以上的互补序列；
g.引物设计完成后要使用BLAST检索确认引物的特异性。
此外，引物的纯化纯度对反应特异性有很大的影响。经过一般纯化、纯度较低的引物荧光强度散乱，容易产生非特异性产物，致使熔解曲线出现杂峰。请尽可能使用HPLC级别纯化，至少要用经Cartridge(OPC)级别以上纯化的引物。
7、对照设计：
a.No template control(NTC)：在qPCR反应体系中仅仅缺少模板。用以检测有无二聚体和试剂有无污染。
b.Reverse Transcripase control：用以评估逆转录反应中有无基因组DNA的污染。在逆转录反应中仅仅不含有逆转录酶。
常见问题及处理：
| 问题 | 可能原因 | 推荐的解决方法 |
| 无扩增曲线且无扩增产物(凝胶电泳) | 反应体系中有PCR反应抑制剂 | 更换或纯化模板DNA。 |
| 引物设计不合理 | 重新设计、合成引物。 | |
| 逆转录产物体积过量 | 减少逆转录产物量以不超过反应体系的10%。 | |
| 加样错误或有试剂未加 | 检查是否加了所有的所需试剂。 | |
| 引物的降解 | 通过PAGE电泳检测引物完整性。 | |
| 退火温度不正确 | 优化退火温度。 | |
| 无扩增曲线但有扩增产物(凝胶电泳) | qPCR仪设置不正确 | 检查dye selction，reference dye是否选择正确 |
| 失效的荧光检测 | 荧光检测应在PCR循环的退火/延伸阶段。 | |
| 荧光PCR仪问题 | 参考qPCR仪器说明书 | |
| 阴性对照(NTC)有扩增曲线 | ||
| 反应体系中有污染 | qPCR片段较小，极易造成环境中气溶胶污染。如果融解曲线分析，解链温度和目的片段相同，凝胶电泳中NTC中的片段大小和目的片段相同，极有可能是反应体系中某一或某些试剂污染所引起的。建议换至没有污染源的环境进行PCR体系的配制。 | |
| 引物二聚体 | 进行溶解曲线分析，如果扩增曲线的解链温度小于80℃，凝胶电泳片段大小和目的片度不符。请重新设计引物。 | |
| 提高退火温度3℃。 | ||
| PCR效率高于110%(斜率>-3.1) | 有非特异性扩增 | 溶解曲线分析非特异性扩增；优化引物设计 |
| PCR扩增效率低于90%(斜率<-3.6) | 反应体系中有PCR反应抑制剂 | 更换或纯化模板DNA |
| PCR扩增条件不合适引起扩增效率降低。 | 确认引物浓度。注意qPCR Master Mix是否失效。 | |
| 引物设计 | 重新设计引物，避免扩增区域的DNA二级结构。 | |
| 实时荧光曲线线性不好 | 模板DNA含量较低或过高 | 应调整样品的DNA浓度。 |
| 模板DNA中含有抑制PCR扩增反应的物质 | 对模板DNA进行纯化或更换模板。 | |
| 质量不好的逆转录试剂盒合成的cDNA，逆转录反应液中所含的物质可能抑制PCR反应。 | 请降低样品浓度，或将样品纯化后再进行反应。建议使用品牌质量较好的cDNA合成逆转录试剂盒。 | |
| CT值高于预期值 | 加入的模板量太少 | 适当增加模板量。 |
| 样品被降解 | 检查样品的完整性。 | |
| 引物不合适 | 重新设计合成引物。 | |
| CT值低于预期值 | 加入了过多的模板 | 减少模板量。 |
| PCR产物太长 | 一般采用100-150bp的产物长度，一般不超过500bp | |
| CT值的标准差>0.16 | 取样不准确 | 每种样品的反应混合液单独配制，充分混匀； |
| qPCR之前要离心，管壁不要沾有反应液。 | ||
| ΔRn值太小 | PCR效率太低 | 优化PCR反应条件。 |
| 目标模板数太低 | 增加模板量。 | |
| 扩增曲线的荧光信号弱，或扩增曲线呈锯齿状 | ROX添加量太大 | 使请根据ROX使用方法和使用的PCR仪进行确定ROX的添加量。 |
| 荧光校正错误 | 请联系PCR仪器工程师或参照PCR仪器的使用说明书，进行本底和荧光校正。 | |
| PCR的延伸时间过短即荧光读取时间不充分，荧光收集不能充分完成。 | 适当增加延伸时间。 | |
| 以少于PCR仪器标准条件的反应体积进行扩增，荧光收集量的误差会增大 | 应增加反应体积以满足PCR仪器标准。 |
储存条件：-20℃，避免反复冻融，有效期半年。
相关搜索：2×SYBR qPCR MasterMix